SAF的示意图如图所示，其中来自13个不同位置的98个样本跨越11个采样会话。1。仅采集了地面样本，因为此次采样活动没有可用的飞行硬件。
　　如前所述，需氧细菌孢子负荷为每平方米36个孢子，约占异养可培养细菌总数的20%[23]。对98个样本中NSA分离株的全长16S rRNA基因进行桑格测序，得到130个分离株，属于16属49种（图2）。97%的这些分离物（126/130）属于芽孢杆菌、短芽孢杆菌、Cohnella、Graciliabacillus、Oceanobacillus、Paenibacillus，Psychrobacills、Rummelibillus、Sporosarcina、Streptomyces、Terribacillus和Virgibacillus的种类，它们通常被认为是孢子形成菌。芽孢杆菌占该种群的大多数，有73个分离株，属于21种。NSA培养的剩余约3%的分离物（4/130）是非孢子形成细菌，由黄体短杆菌（Brevibacterium lutolum）、联合马西利亚菌（Massilia consociata）、云南微球菌（Micrococcus yunnanensis）和溶血葡萄球菌（Staphylococcus溶血葡萄球菌）组成。当重新测试这些分离物的耐热性时， 在80℃热冲击15分钟后，它们再次显示出在电镀后的存活。
　　当进行空间分析时，49个已识别物种中的36个物种并不普遍，并且在给定的SAF位置仅分离一次。空间上最丰富的分离物是枯草芽孢杆菌，在SAF的13个采样位置中的9个位置发现了枯草芽孢杆菌（图2a）。当在11个采样期内对分离物进行时间分析时，大多数物种（30/49，约61%）在给定采样期内的6个月采样期内仅分离一次。时间上最丰富的物种是泛热肠杆菌（Virgibacillus panthonthenticus）（17个分离株）和枯草杆菌（14个分离株，它们在7个单独的采样阶段从SAF地板上分离出来（图2a），其次是在6个采样阶段发现的短小芽孢杆菌（14种分离株）。培养的分离物之间的系统发育关系如图所示。2a， 其中四个分离物代表潜在的新物种，因为它们与任何有效描述的物种的16S rRNA序列具有≤98.7%的序列相似性。在已鉴定的16个属中，3个属也在16S rRNA基因Illumina扩增子测序分析中被鉴定，所有样本的读数均超过100。在这两种方法鉴定的3个属中，一个属是芽孢形成菌（Bacillus），而另外两个属（Massillia和Staphylococcus）是非芽孢形成菌，但耐热。
　　每个样本的读取计数在不同类型的样本中有所不同（Kruskal-Wallis P<0.0001，KW=93.15），其中PMA未处理的样本的计数高于PMA处理的样本（P<0.00001）和对照组（无论处理如何）[PMA-（P<0.001）和PMA+对照组（P<0.001]（图3a）。微生物丰富度在不同类型的样品中也存在差异（Kruskal-Wallis P<0.0001，KW=84.31），PMA未处理样品的丰富度高于PMA处理样品和对照（P<0.00001）（图3b）。PMA处理的样品或对照组之间的丰富度没有差异。UniFrac未加权（图3c）和加权（图3d）分析显示PMA处理的差异β多样性。与PMA处理相关的特征（1250个总属中的180个）的热图表示如图所示，该热图表示是使用Calour（一种以微生物为中心的交互式分析工具[53]）中基于等级的差异丰度测量计算的。3e， 显然PMA处理去除了大部分死亡微生物。当从给定采样日期和地点的PMA和非PMA样本中检测和比较序列时，平均约33%的OTU丰度被确定为来自活细胞或由于加工过程中的背景污染而存在。
　　除了对RPCA产生的Aitchison距离进行PCA外，还通过未加权和加权UniFrac上的PCoA评估16S rRNA基因扩增子测序组成的变化。PMA处理和收集时间点导致了微生物群的显著差异（图3f），并导致了解释的总效应大小的大部分（表S1）。PMA处理导致的β多样性的这些变化部分归因于假单胞菌（目）相对于Bacilli（类）的对数比率的降低（图3g）。使用假单胞菌（顺序）与Bacilli（类别）的对数比率来理解微生物多样性的变化，因为与假单胞菌相关的读数在采样环境中没有增加，而Bacilli读数在入口与设施内部之间有所增加。
　　为了解释数据的重复测量结构（即时间），CTF用于探索SAF位置之间的微生物群落变化。CTF而非RPCA、加权或未加权-UniFracβ多样性距离揭示了SAF房间位置之间的显著差异（表S2）。房间中的差异部分由根瘤菌（变形杆菌）与芽孢杆菌（厚壁菌）的对数比率来解释（图S1a；图S1b）。随着设施入口半径的增加，还观察到根瘤菌（变形杆菌）与芽孢杆菌（厚壁菌）的对数比率降低。我们进一步假设，鉴于已知的芽孢形成能力，芽孢的弹性可能是SAF房间位置之间观察到的变化的驱动因素。根瘤菌和芽孢杆菌通常都存在于环境中，因此很容易从外部来源带入。但根瘤菌是非孢子形成的，在远离入口的地方很可能是不存活的， 注意并计算了两者之间比率的变化。
　　使用Deutsche Sammlung von Mikrooorganismers und Zellculturen（DSMZ）BacDive数据库的祖状态重建，通过SEPP插入树预测孢子形成能力（平均精度=0.83；图S2）。预测的非孢子形成微生物和孢子形成微生物的位置平均对数比率与距SAF设施入口的径向距离相关（Pearson相关（r=0.61，P=0.027；图4a），表明与非孢子形成菌相比，孢子形成菌的数量随着远离入口而减少。使用AGP和EMP源数据集对每个房间随时间的微生物源进行跟踪，揭示了SAF污染细菌的可能来源。随着入口半径的增加，动物表面（AGP；皮肤）的贡献减少，土壤（EMP；非盐水）来源的贡献增加（图4b）。非盐水表面（EMP） 也有助于作为源环境，但除了在800像素的半径处的尖峰之外保持稳定。
　　对所比较的所有设施的详细描述和解释超出了本报告的范围，但我们提供了当前时间序列SAF数据与之前的100拭子KatharoSeq JPL-SAF数据、一个新生儿重症监护室、一个鲍鱼饲养设施、，以及三个国际空间站（ISS）环境数据，用于表征一系列低生物量环境并将其相互关联（图4c，d）[1]。在五个环境中的每一个环境中，极其清洁的鲍鱼养殖设施都表现出与其他设施楼层完全不同的微生物特征。尽管所有其他设施在微生物多样性方面看起来相似（图4c）， 加权Unifrac分析的详细特征表明，与JPL-SAF时间序列样本相比，新生儿重症监护室和ISS表面的微生物多样性组成存在差异。与之前的JPL KatharoSeq研究相比，本次JPL时间序列数据点的微生物群落组成有所不同（图4d）。
　　在PMA处理的样品中，所有样品的总读数超过100，共鉴定出46个非孢子形成属和8个孢子形成属（图5）。在非对照PMA处理的样品中，读数分解为4.28%（NSA孢子形成物）、9.66%（非NSA孢子生成物）和86.05%（非孢子形成物。在PMA处理的样品中鉴定出的十个最主要的属是鞘氨醇菌属、假单胞菌属、粪杆菌属、梭状芽孢杆菌属、不动杆菌属、偶氮螺旋菌属、芽孢杆菌属，Deinococcus属，不动杆菌和节杆菌属。在十个最突出的总属中，只有两个属（梭状芽孢杆菌属和芽孢杆菌属）是孢子形成菌。这八个孢子形成属分别是梭状芽孢杆菌、芽孢杆菌、放线菌属、地芽孢杆菌属、放线酵母属、多力子菌属、微孢子菌属和分枝杆菌属。
　　芽孢杆菌属和放线菌属是PMA样品中检测到的唯一两种NSA孢子形成菌。芽孢杆菌是时间上最频繁的NSA孢子形成菌，在第2、3、4、5、6、7、10和11次采样中，其读数比放线菌多。或者，在PMA样品中检测到总共六种非NSA孢子形成物（放线菌、梭状芽孢杆菌、多力子菌、地芽孢杆菌、微孢子菌、分枝杆菌）。土芽孢杆菌是时间上最丰富的非NSA孢子形成体，在第一次采样过程中非NSA的孢子形成体读数最多。在PMA样品中共检测到46种非孢子形成物。每个采样阶段最丰富的非孢子属各不相同；然而，不动杆菌在第二次和第四次采样中的读数最多。
　　NSA孢子、非NSA孢子形成物和非孢子形成物的比较没有显示出任何一致的微生物种群模式（图5a）。然而，与非NSA孢子形成剂相比，采样阶段4、6和8的NSA孢子读数更高。在其他每一次采样过程中，非NSA孢子读数都大于NSA孢子的读数。此外，非孢子形成物的读数大于NSA孢子和非NSA孢子类别在每个采样阶段的总读数。图5b，c中用NSA孢子和非NSA孢子的读数计算的扩增子测序读数的热图清楚地表明，与孢子相关的读数在对照组中少于100个读数（1个现场对照组除外），并且在第8次采样期间采集样品时最为丰富。13个地点的活微生物种群（PMA处理的样品）的空间和时间分布如图所示。5d。位置#5、7， 和8显示通过NSA方法可检测到的孢子的存在高于非NSA孢子。在其他地区发现非NSA孢子形成物的发生率较高，这证实了NSA方法错过了大多数可能需要其他最佳培养条件才能生长的孢子形成物。此外，不能排除这些孢子形成微生物可能处于营养细胞状态，并在80°C期间被杀死；NSA方法的15分钟热冲击程序。值得注意的是，与孢子形成者相比，所有这些位置都有更多的非孢子形成成员。
　　芽孢杆菌是空间上最丰富的NSA孢子形成体，其NSA孢子生成体总量最高，位于位置12。地芽孢杆菌是空间上最常见的非NSA孢子形成体，位置1中非NSA的孢子形成体读数最多。空间上最丰富的非孢子形成体是鞘氨醇菌，位置10的读数较高（图5c）。
　　在PMA现场对照中未检测到NSA孢子形成物。在PMA阴性对照中仅检测到芽孢杆菌（2个读数）。对照组中最丰富的非NSA孢子形成物是PMA现场对照中的梭状芽孢杆菌（136个读数）和PMA阴性对照中的土芽孢杆菌（6个读数）。PMA现场对照中最丰富的非孢子形成物是不动杆菌（518个读数）和PMA阴性对照中的Dorea（370个读数）（图5b，c）。
　　如Hendrickson等人（2017）之前所述，通过FACS分析了25个样本，以估计活微生物的数量。通过FACS鉴定的活细胞被随机分类到384孔微孔板中，从每个测试样品中收集317个单独的细胞（图6a）。对于这项研究，样本2016-07-12位置#1被选择用于单细胞基因组学分析的原理证明，并且是唯一使用所有三种方法（NSA、扩增子测序和单细胞基因组测序）进行分析的样本。选择该样本是因为它位于更靠近洁净室入口的位置，并且据证明具有更高的活生物负载（每平方米8.8 x 105个活细胞）进行分析。此外，该样品上的平均孢子数为每平方米表面积35个孢子，091 [23]. 其中一个微板的16S rRNA基因的基因组测序和PCR筛选的组合确定了317个产生的SAG中的78个的分类隶属关系（图6b）。在已鉴定的SAG中，72个被鉴定为不动杆菌，3个被鉴定是鞘氨醇单胞菌，2个被鉴定成副球菌，1个被鉴定出铜三菌。通过对另外两个SAG微板的16S rRNA基因PCR筛选，还发现了其他属，包括Microvirga和Novosphinglobium。RedoxSensor Green阳性细胞的大小、花期和身份如图所示。6b。
尘埃粒子计数